Вирус простого герпеса (ВПГ) 1 и 2 типа вызывает генитальные инфекции и является наиболее распространенной причиной язвенной болезни половых органов. При этом большинство из них по-прежнему недооцениваются. Клинический диагноз генитального герпеса всегда должен подтверждаться лабораторными анализами.
Это может быть достигнуто с помощью прямых тестов на изоляцию вируса, обнаружения антигена или ДНК ВПГ с использованием методов молекулярной диагностики. Все более популярной процедурой становится тестирование серотипов, которое позволяет точно диагностировать и направлять клиническое лечение для отдельных пациентов.
Виды анализов
Первичный орофациальный герпес идентифицируется с помощью клинического обследования. Множественные, круглые, поверхностные язвы в ротовой полости сопровождаются острым гингивитом (при поражениях в других зонах первичный орофациальный герпес иногда ошибочно принимают за бактериальную инфекцию).
Диагностика герпеса: осмотр, выделение культуры вируса, иммунофлуоресцентный анализ для выявления антител, ПЦР для ДНК вируса,биопсия кожи.
Результаты лабораторных методов могут быть ложноотрицательными, при сомнениях следует их повторить.
Сложнее диагностировать нетипичные представления. Симптомы продромального периода, которые возникают до появления герпетических поражений, помогают дифференцировать признаки ВПГ от подобных проявлений других расстройств (например, аллергический стоматит).
Часто герпесовирусные инфекции скрываются под совершенно другими заболеваниями.
Поэтому при симптомах хронической усталости и субфебрильной температуре неясного генеза обязательно необходимо сдать общий анализ крови с лейкоформулой.
При завышенных показателях лейкоцитов и моноцитов проводят анализ ИФА и ПЦР, указывающий на один из 4 типов герпеса. Каждый из них может быть причиной полиартрита и гепатита.
Генитальный герпес может быть сложным для распознавания, поскольку ВПГ-2 часто не проявляется классическими симптомами. Кроме того, несколько других состояний напоминают его, включая грибковую инфекцию, плоский лишай, атопический дерматит и уретрит.
Для его подтверждения используются лабораторные исследования, которые включают:
- выделение культуры вируса;
- иммунофлуоресцентный анализ (метод флуоресцирующих антител);
- полимеразную цепную реакцию для проверки наличия вирусной ДНК;
- биопсию кожи.
Тестирование серотипов рекомендуется ради прогностических и консультационных последствий. Серологическое тестирование полезно для пациентов с симптомами, когда прямые методы демонстрируют отрицательные результаты, или когда признаки инфекции не проявляются.
Образцы, полученные из везикулярных поражений в течение первых трех дней после их появления, являются выборками, но необходимы мазки генитальных секретов от ранних повреждений, если подозрение на инфекцию велико.
Тест актуален, когда вирус активен, но если пузырьки маленького размера или уже начинают заживать (покрываться коркой), то их может быть недостаточно для подтверждения диагноза. Спирт или йодофоры для очистки поражений могут инактивировать вирус и поэтому их избегают. Альгинат кальция токсичен для ВПГ и также не используется.
Везикулу вскрывают стерильной иглой или скальпелем. Зонд-тампон в пробирке с транспортной средой плотно вращают в основание поражения, чтобы собрать эпителиальные клетки (на тампон). Аналогично при язвах тампон прочно поворачивают в основание одного или нескольких повреждений.
Мазок незамедлительно вставляют в вирусную транспортную среду. Ось тампона обламывают, чтобы она не мешала закрытию, и покрывают пробирку колпачком. Образец должен храниться при температуре 4° C, и обработан в лаборатории в течение 48 часов.
Иммунофлуоресцентная микроскопия – метод обнаружения антигенов с помощью флуоресцентно помеченных антител. Предлагает хорошую возможность визуализации внутриклеточных процессов, состояний и структур. Для исследования клиницист прокатывает тампон с собранной культурой на слайд микроскопа.
Почему нашим статьям можно доверять ?
Мы делаем медицинскую информацию понятной, доступной и актуальной.
- Все статьи проверяют практикующие врачи.
- Берем за основу научную литературу и последние исследования.
- Публикуем подробные статьи, отвечающие на все вопросы.
Альтернативно основание поражения очищается шпателем или аналогичным инструментом, а полученный материал наносится на стекло в одну или несколько областей (диаметром от 5 до 10 мм). Для иммунофлуоресцентного анализа лучше сделать несколько мазков, чтобы можно было использовать специфические антитела с флуоресцентными маркерами ВПГ-1 и ВПГ-2.
Полимеразная цепная реакция – революционный метод молекулярной биологии, учитывающий способность ДНК-полимеразы синтезировать новую цепь ДНК, комплементарную предложенной матрице.
Образцы, взятые для выделения или обнаружения антигена, подходят для детектирования ДНК. Метод, основанный на амплификации нуклеиновых кислот, гарантирует, что даже образцы с минимальным количеством клеток, могут быть проанализированы.
Если у пациента нет видимых симптомов, но присутствуют опасения относительно наличия герпеса, используются анализы крови. Но они фактически не обнаруживают вирус, а вместо этого ищут антитела в крови (или иммунный ответ организма).
Показания
Изоляция культуры представляет традиционный («золотой») стандарт для обнаружения ВПГ, эталонный метод, по которому оцениваются все остальные тесты. Но хотя тест на 100% специфичен для ВПГ-1 и ВПГ-2 чувствительность зависит от стадии поражения во время сбора образца. Поэтому рекомендуется делать его в течение 48 часов после появления поражения (результаты, как правило, доступны через неделю).
От состояния и чувствительности клеточных линий варьируется время изоляции ВПГ (вирус быстро растет в широком спектре клеточных линий). Большинство изолятов проявляют видимый цитопатический эффект через два-три дня культивирования.
Основное преимущество анализа – предоставление точного положительного результата. Также можно определить вызвана инфекция ВПГ-1 или ВПГ-2. Но всё же недостаток в определенном уровне ложноотрицательных результатов.
Обнаружение вирусного антигена – подходящая альтернатива выборке культуры, когда условия обработки образцов и транспортировки могут инактивировать любой присутствующий вирус. Предметное стекло исследуется с применением флуоресцентного микроскопа с положительным тестом, обозначенным наличием характерной картины яблочно-зеленой флуоресценции в ядре и цитоплазме базальных и парабазальных клеток.
Исследуются только интактные клетки. Результат неубедителен, если в каждой лунке стекла присутствует их менее 50. Инфекция ВПГ вызывает типичные цитопатические изменения в генитальных эпителиальных клетках. Они заметно увеличиваются, имеют внутриядерные включения (часто с образованием многоядерных клеток).
ПЦР обнаруживают вирусную ДНК в течение нескольких дней после того, как поражения уже не содержат демонстративного инфекционного вируса. Это может означать то, что анализы, основанные на амплификации нуклеиновой кислоты, гарантируют большее число положительных результатов на полученных образцах. При этом несмотря на то, что ПЦР обнаруживает ДНК вируса на более поздних стадиях поражениях (в отличие от культуры), существует теоретический риск ложноположительных результатов.
Прежде всего, они могут возникнуть из-за загрязнения образца перед амплификацией, поэтому очень важно иметь соблюдать все меры предосторожности, связанные с отделенной областью для анализа, отдельным оборудованием для предварительной и последующей обработки материалов.
При несогласованных результатах (по ПЦР и изоляции культуры) проводится дополнительный анализ ПЦР, направленный на другой ген, обеспечивая, таким образом, его специфичность.
Тестирование ВПГ-антител обнаруживает иммунные белки, которые организм вырабатывает в ответ на инфекцию герпеса. Он продуцирует два класса антител:
- IgM – через несколько дней после первичной инфекции ВПГ (антитела могут обнаруживаться в крови в течение нескольких недель).
- IgG – после IgM. Уровень IgG растёт в течение нескольких недель, медленно снижается, а затем стабилизируются в крови.
Многие полагают, что если тест обнаружил IgM, то они недавно приобрели герпес. Это ошибочное мнение, исследования показывают, что оно может появляться в крови снова и во время рецидивов.
Таким образом, данный анализ иногда приводит к ложным предположениям о том, как и когда человек приобрел ВПГ. Кроме того, тест IgM не может точно различить антитела ВПГ-1 и ВПГ-2, что легко обеспечивает ложноположительным результатом для вируса простого герпеса второго типа.
В любом случае серологические тесты позволяют диагностировать, когда не могут быть выполнены другие вирусологические методы (или они дают отрицательные результаты). Они особенно полезны при идентификации бессимптомного носителя инфекции, учитывая, что в большинстве случаев заражение происходит без видимых признаков.
Результаты
Положительный результат ВПГ при выделении культуры или теста на ДНК (ПЦР) указывает на активную инфекцию ВПГ-1 или ВПГ-2. Отрицательный результат говорит о том, что вирус не был обнаружен, но определенно исключать его нельзя. Материал может содержать мало копий вируса, или не иметь его активной репликации. Если подозрение на герпес остается высоким, выполняется повторное тестирование.
Положительный результат на антитела показывает активную или недавно приобретенную инфекцию благодаря значительному увеличению IgG.Отрицательный результат антител к ВПГ означают то, что пациент не инфицирован или его организм ещё не успел начать продуцировать антитела к вирусу.
Среди ряда противовирусных препаратов для лечения ВПГ наиболее часто применяется Ацикловир. Но почти все клинически значимые штаммы, устойчивые к нему, наблюдаются у пациентов с ослабленным иммунитетом.
Развитие резистентности обычно возникает в результате мутаций в вирусном геноме, а наличие избирательного давления лекарственного средства приводит к появлению устойчивой популяции вирусов. Противовирусная активность ацикловира требует начальной стадии фосфорилирования вирусным ферментом тимидинкиназы (ТК).
Две последующие стадии опосредуются клеточными киназами. Полученный трифосфорилированный ацикловир затем специфически ингибирует ДНК-полимеразы герпесвируса. Были идентифицированы три разных механизма резистентности ВПГ к ацикловиру.
Наиболее часто встречаются вирусы, у которых нет функциональных TK и, таким образом, они неспособны монофосфорилировать ацикловир. Реже некоторые устойчивые вирусы производят функциональный TK-фермент, который неспособен фосфорилировать препарат из-за измененной субстратной специфичности. Наконец, резистентность может быть вызвана мутациями, приводящими к изменению связывания ДНК-полимеразы и ее использования ацикловиром.
Фоскарнет непосредственно ингибирует ДНК-полимеразы герпесвируса, и резистентность развивается из-за измененных вирусных ДНК-полимераз. Также редко и сопротивление видарабина.
Сложность анализов чувствительности к лекарственным средствам для противовирусной резистентности ограничена их доступностью. В настоящее время они выполняются только специализированными учреждениями.
